Roche Romania

Portofoliul 454 Sequencing

454 Sequencing utilizeaza tehnologia secventarii-prin-sinteza next-generation, ce sta la baza functionarii celor doua platforme de secventare oferite de Roche. Nucleotidele sunt introduse secvential in dispozitivul de reactie, intr-o ordine fixa pe durata rundei de secventare, fiind indepartate in flux continuu. In acest rastimp, sunt secventate in paralel sute de mii de sfere purtatoare a milioane de copii dintr-o unica molecula de ADN monocatenar. Atunci cand un godeu de reactie primeste o nucleotida complementara cu catena ADN tinta, polimeraza o adauga, extinzand tinta. La aditia uneia sau mai multor nucleotide,  se genereaza un semnal luminos care este preluat si inregistrat de camera CCD (charged-couple device) a instrumentului. Intensitatea semnalului este proportionala cu numarul de nucleotide incorporat intr-un singur flux. Semnalul capturat este decriptat pe baza unei secvente consens tetramerice si transformat in imagine bruta ce va fi prelucrata in continuare de sistemul bioinformatic asociat platformei.

Portofoliul Roche 454 Sequencing de produse pentru secventare se compune din instrumente de secventare, reactivi, modulul de automatizare a etapei de imbogatire prin PCR, sistemul bioinformatic si programele de analiza de date.

Instrumentele Genome Sequencer

Genome Sequencer FLX

GS Junior

Trusele GS FLX Titanium*

• GS FLX Titanium Rapid Library Preparation Kit
• GS FLX Titanium Rapid Library MID Adaptors Kit
• GS FLX Titanium General Library Preparation Kit
• GS FLX Titanium Library Paired End Adaptors
• GS FLX Titanium LV emPCR Kit (Lib-L)
• GS FLX Titanium MV emPCR Kit (Lib-L)
• GS FLX Titanium SV emPCR Kit (Lib-L)
• GS FLX Titanium LV emPCR Kit (Lib-A)
• GS FLX Titanium MV emPCR Kit (Lib-A)
• GS FLX Titanium SV emPCR Kit (Lib-A)
• GS FLX Titanium emPCR Breaking Kits LV/MV 12pc
• GS FLX Titanium emPCR Filters SV 64pc
• GS FLX Titanium Sequencing Kit XLR70
• GS FLX Titanium PicoTiterPlate Kit

* Pentru mai multe informatii, va rugam sa ne contactati

Trusele GS Junior Titanium

• GS FLX Titanium Rapid Library Preparation Kit
• GS FLX Titanium Rapid Library MID Adaptors Kit
• GS Junior Titanium emPCR Kit (Lib-L)
• GS Junior Titanium emPCR Kit (Lib-A)
• GS Junior Titanium Sequencing Kit
• GS Junior Titanium PicoTiterPlate Kit

Formatul truselor de secventare este prezentat aici.

Modulul automat REM e

Sistemul REM e este compatibil cu sistemele robotizate de extractie a acizilor nucleici Hamilton Star/STARlet, Tecan Genesis RSP 100 si Biomek FX.

Sistemul bioinformatic extern

GS FLX Titanium Data Computing Cluster. Pentru configurarea corecta a unui alt sistem informatic extern de analiza a datelor va rugam sa ne contactati.

Fluxul de lucru

1. Probele de analizat si fragmentarea

Sistemele GS permit secventarea probelor provenite dintr-o multitudine de surse biologice, incluzand ADN genomic, produsi PCR, BAC si ADNc. Probele de ADN genomic sau BAC sunt fragmentate aleator in portiuni mici, de 300-800 pb. Probele cu dimensiuni mai mici, cum sunt ARN non-codant de dimensiuni mici sau ampliconii (produsi PCR) nu necesita fragmentare. Produsii PCR amplificati folosind primeri Genome Sequencer fusion primers pot fi imobilizati pe sfere de captura a ADN si amplificati clonal asa cum se arata in paragraful "Un Fragment = O Sfera".

2. Prepararea librariilor

Folosind o serie de tehnici de biologie moleculara standard, se adauga adaptori ADN scurti la fiecare fragment de ADN din librarie. Acesti adaptori sunt apoi folositi la cuantificarea, amplificarea si secventarea ulterioara.

3. Un Fragment = O Sfera

Libraria de ADN monocatenar este imobilizata pe DNA Capture Beads cu design specific. Fiecare sfera (Bead) poarta un singur fragment de ADN monocatenar din librarie. Libraria imobilizata pe sfere este emulsifiata cu reactivi de amplificare, intr-un amestec apa-in-ulei, generand microreactori ce contin o singura sfera ce poarta un unic fragment din libraria de analizat.

4. Amplificarea prin emPCR (Emulsion PCR)

Fiecare fragment unic din librarie este amplificat clonal in interiorul propriului microreactor, excluzand secventele competitoare sau de contaminare. Amplificarea intregii colectii de fragmente are loc in paralel; pentru fiecare fragment, acest procedeu produce mai multe milioane de copii ale fragmentului original, atasate pe sfera de captura. Ulterior, emulsiile sunt sparte pentru a facilita colectarea fragmentelor amplificate.

5. O Sfera = O Citire (Read)

Fragmentele amplifcate clonal sunt imbogatite si incarcate in dispozitivul PicoTiterPlate in vederea secventarii. Diametrul godeurilor PicoTiterPlate este astfel proiectat incat sa permita accesul unei singure sfere in fiecare godeu. Dupa adaugarea enzimelor si a reactivilor necesari secventarii (toti atasati pe sfere specifice de diferite dimensiuni), subsistemul circulator (fluidics) al sistemului Genome Sequencer injecteaza serial nucleotide intr-o ordine prestabilita (adica mai intai T, apoi A, si asa mai departe) pe diagonala sutelor de mii de godeuri ce contin, FIECARE, doar cate o singura sfera cu un fragment atasat. Adaugarea uneia sau mai multor nucleotide, complementare catenelor matrita de secventat, conduce la generarea unui semnal chimioluminiscent ce va fi inregistrat de camera CCD a sistemului Genome Sequencer. Intensitatea semnalului rezultat este proportionala cu numarul de baze incorporate.

6. Analiza datelor

Combinatia dintre intensitatea semnalului si informatia despre pozitia in dispozitivul PicoTiterPlate permite programului sa determine simultan secventa a 100.000-100.000.000 de citiri individuale  in 10 ore de lucru. Pentru analiza datelor astfel obtinute sunt disponibile 3 instrumente bioinformatice diferite, incluse in sistem, pentru urmatoarele aplicatii: asamblare genoame de novo; resecventare/mapare genoame de orice dimensiune; si detectie variante ampliconi prin comparatie cu secvente de referinta cunoscute.

Programele de analiza de date

• GS De Novo Assembler, pentru prelucrarea genoamelor (ADN) si a transcriptoamelor (ADNc) mai mari si mai complexe
• GS Reference Mapper,  pentru maparea citirilor fata de oricare genom de referinta, cu generarea unei secvente consens
• GS Amplicon Variant Analyzer, pentru (i) alinierea automata a citirilor provenite de la probe de tip amplicon fata de o secventa de referinta; (ii) identificarea rapida a variantelor si a frecventei acestora in pool-uri mari de probe; (iii) compararea cu variantele cunoscute pe baza de referinta si descoperirea variantelor noi; (iv) haplotipare/repetitivitate, cu identificarea variantelor de lincaj; (v) detectia variantelor cu frecventa joasa (<1%).

Optiuni de design experimental

Genome Sequencer FLX si GS Junior ofera multiple optiuni experimentale, si anume:

• Citiri unice lungi:  peste 1.000.000 de citiri unice, avand lungimea medie de 400 de baze pe citire; daca tintele sunt SNPs, insertii sau deletii, gene sau regiuni genomice noi, citirile unice lungi permit investigarea mai larga a genomului integral.
• Citiri Multi Span Paired End: combinatia imbatabila de citiri multi-span (3 kb, 8 kb, 20 kb) paired end si shotgun lungi, impreuna cu instrumentele de analiza incluse in program, ofera solutia completa de secventare de novo de la un capat genomic la celalalt si schita de buna calitate a ansamblului, generata pe baza seriilor de segmente de ADN clonate (contigs) mai lungi si a scheletelor mai largi si mai reduse numeric.
• Citirile paired end (cunoscute si sub denumirea de citiri "mate pair") suplimenteaza citirile shotgun, imbunatatind semnificativ asamblarile de novo prin acoperirea completa sau partiala a regiunilor genomice repetitive. Citirile paired end contribuie la ordonarea contigs in schelete largi, determinarea secventei in interiorul regiunilor repetitive largi si identificarea variatiilor structurale (incluzand insertii, deletii, rearanjamente si variatii ale numarului de copii).
• Secventarea ampliconilor este metoda ideala pentru: (i) descoperirea mutatiilor somatice sau din linia germinativa in probe complexe (ex. tumori canceroase mixate cu ADN de linie germinativa), bazata pe secventare superioara (ultra-deep); (ii) analiza cvasispeciilor prezente in populatiile infectate, in contextul studiilor epidemiologice (ex. mutantele HIV rezistente la terapie); (iii) secventarea colectiilor de exoni umani in vederea identificarii alelelor rare asociate cu maladii; (iv) secventarea ARNr 16S pentru studiul filogeniei si taxonomiei bacteriilor in analiza metagenomica a probelor combinate.
• Imbogatirea genomica dirijata folosind arrays NimbleGen Sequence Capture.
• Multiplex Identifiers (MIDs)