Proteomica
Sisteme pentru expresie proteica
Daca o proteina codificata de o gena sau fragment de gena cunoscuta trebuie analizata, veti incepe prin a clona secventa ADN intr-un vector specializat ce permite transcrierea acelei secvente. Pentru translatia ARNm generat intr-o proteina sunt disponibile mai multe metode, grupate in sisteme celulare si sisteme acelulare.
Sistemele celulare. Aceste sisteme implica productia unei proteine pornind de la o structura realizata in interiorul unei celule vii. Celulele astfel modificate (bacterii, drojdii si celule animale) vor fi cultivate pe medii de cultura artificiale. Selectia celulelor potrivite este cruciala deoarece prelucrarea post-translationala a proteinelor (glicozilare, fosforilare, acilare) este posibila doar la eukariote si poate varia cu tipul celular. In plus, multe proteine nu sunt conformate corect in sisteme celulare prokariote.
Sistemele acelulare. In expresia genica in sistem acelular, gena de interes este transcrisa in vitro de o polimeraza ARN (SP6 ori T7), apoi ARN este translatat folosind un lizat de germeni de grau sau reticulocite. Avantajele multiple ale sistemelor acelulare sunt marcarea facila a proteinelor, exprimarea proteinelor toxice sau apoptotice, precum si compatibilitatea cu studiile de co-expresie proteica. In ciuda acestor beneficii, impedimentul major al sistemelor acelulare a fost intotdeauna nivelul extrem de redus (nanograme) de proteina exprimata, suficient doar pentru cercetare. RTS (rapid translation systems) elimina aceasta limitare, utilizand un lizat de E. coli si preintampinand inhibitia reactiei de trancriere/translatie prin tehnica cunoscuta sub denumirea de tehnologia schimbului permanent. Folosind RTS puteti obtine miligrame de proteina peste noapte, intr-o singura reactie. De asemena, va invitam sa consultati si oferta noastra completa pentru transcriere/translatie clasica in vitro, ce include trusa de transcriptie SP6/T7 si polimerazele SP6, T3 si T7.
Roche Applied Science va pune la dispozitie mai multi reactivi si truse atat pentru biosinteza proteica in sisteme celulare sau acelulare din gene clonate. Consultati aceasta sectiune.
Prelucrarea si purificarea proteinelor
Cultivarea celulelor eukariote necesita reactivi de calitate foarte buna pentru mentinerea indelungata a culturilor in conditii constante si reproductibile. In multe situatii sunt necesare suplimente de mediu pentru satisfacerea cerintelor de crestere ale anumitor linii celulare sau celule primare, precum si mentinerea starii lor de diferentiere pentru a evita alterarile profilurilor de expresie proteica.
Producerea lizatelor necesita detergenti care sa nu formeze agregate insolubile cu proteinele, iar disocierea tesuturilor cere adesea enzime adecvate (de exemplu colagenaza, liberaza, etc.). Daca liza celulara are loc in conditii nedenaturante, proteazele eliberate din compartimentele celulare pot ridica probleme serioase, asa incat se recomanda folosirea unui inhibitor de proteaze sau a unui cocktail de inhibitori. Dupa purificare veti avea nevoie de digestie proteazica, mai ales atunci cand vizati analiza prin spectrometrie de masa.
Caracterizarea proteinelor
In vederea caracterizarii proteinelor identificate ca produsi specifici ai unei gene puteti apela la investigarea caii secretoare asociate (analiza glicanilor), a localizarii subcelulare sau a profilurilor de expresie in diferite tipuri celulare (prin sisteme de marcare si mijloace de detectie). Marcate cu biotina, digoxigenina, fluoresceina sau enzime, proteinele pot fi detectate calitativ si cantitativ prin metode cum sunt Western blot sau ELISA.
Analiza cailor celulare
In organismele multicelulare exista doua tipuri de proteine tipice, cele codificate de gene housekeeping (exprimate in practic toate celulele si in toate stadiile ontogeniei), si cele codificate de gene reglate, exprimate doar in celule specializate sau in anumite stadii de dezvoltare. Aceste studii de transductie a semnalelor sunt mult facilitate prin folosirea genelor reporter, ce codifica proteine detectabile. In plus, determinarile de proliferare celulara si apoptoza pot oferi indicii asupra implicarii unui produs genic in cascadele reglatoare ce controleaza cresterea celulara. Pentru tabloul complet al mijloacelor de investigatie din acest domeniu, va invitam sa incepeti prin a consulta aceasta brosura, apoi sectiunea de Biologie celulara.