Roche Romania

Datorita PCR (Polymerase Chain Reaction), cantitatea de acizi nucleici de studiat, oricat de mica ar fi, nu mai reprezinta o limitare in cercetare si nici in multe dintre procedeele de diagnostic. Roche Applied Science va ofera o bogata selectie de reactivi de calitate premium pentru amplificarea acizilor nucleici, de folosit in aplicatiile de tip PCR, din care urmeaza doar o selectie in continuare:

• Detectia si analiza in timp real cu instrumentatie automata (de ex., LightCycler cu carusel, LightCycler 480 si COBAS TaqMan 48)
• Amplificarea clonala a ADN genomic in emulsie (emPCR) pentru secventarea ultra-rapida (de ex., GS FLX si GS Junior)
• Introducerea “etichetelor” moleculare (tags), cum sunt biotina si digoxigenina, in produsii PCR pe durata amplificarii, astfel incat acesti produsi sa poata fi utilizati ca sonde de hibridizare sensibile in testele medicale de diagnostic sau de cercetare
• Amplificarea simultana a mai multor secvente intr-o singura reactie (PCR multiplex), pentru identificarea, de exemplu, a SNP in ADN genomic uman
• Studiul variabilitatii genetice pentru descifrarea bazelor genetice ale bolilor
• Amplificarea ADN pentru testarea identitatii (fingerprinting)
• Studiul mecanismelor epigenetice (cum sunt metilarea ADN, acetilarea histonelor, ARN de interferenta) implicate in activarea si inactivarea genelor
• Crearea de ADN nou, prin mutageneza in vitro

• Explorarea relatiilor evolutive, prin examinarea ADN fosil.

Reactivi pentru PCR si RT-PCR in 2 pasi

• Expand Reverse Transcriptase, trusa ideala pentru RT-PCR, pentru tinte de pana la 13,5 kb.
• First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-PCR (AMV), o trusa de sinteza a ADNc si PCR in doua etape, ce contine toti reactivii necesari, incluzand 2 primeri (oligo-dT si random primer) si reactiile de control. Temperatura crescuta de reactie a AMV, prin comparatie cu revers-transcriptaza M-MuLV, permite reactia la 42°C, cu o mai mare specificitate si o rezolutie crescuta a structurilor secundare, fata de reactiile la 37°C.
• Reverse Transcriptase M-MuLV, enzima folosita la sinteza in vitro a ADNc transcris dupa secvente specifice ARN, prepararea librariilor ADNc, sau sinteza primei catene ADNc pentru RT-PCR.
• Reverse Transcriptase AMV, enzima  potrivita pentru sinteza primei si celei de-a doua catene ADNc, precum si pentru sinteza dideoxi-ADN in vederea secventarii. Enzima mai poate fi folosita si la extensia primerilor, secventarea ARN, marcarea 3'-ADN, generarea sondelor monocatenare pentru hibridizare si experimentele de footprint genomic*.
• cDNA Synthesis System este un procedeu intr-o singura etapa, bazat pe metoda lui Gubler si Hoffmann, optimizat pentru sinteza ADNc dublu catenar pornind de la ARN total sau ARNm. ADNc dublu catenar poate fi folosit la constructia librariilor non-directionale, ca punct de pornire in hibridizarea substractiva**, precum si pentru transcrierea in vitro a populatiilor ADNc integrale pentru generarea ARNc marcat, in vederea hibridizarii pe microarrays. Hibridizarea substractiva de supresie a fost folosita cu succes la identificarea secventelor ADN specifice de tulpina sau de specie dintr-o varietate larga de bacterii.
• 5’/3’ RACE Kit, 2nd Generation amplifica secventele ADN pornind de la o matrita de ARNm, definita intre un sit intern si secvente necunoscute de la capetele 3’ sau 5’. Trusa contine toate componentele necesare pentru RACE (rapid amplification of cDNA-ends), incluzand revers-transcriptaza, dNTP, tampoane, controale, primeri si High Pure PCR Product Purification Kit.
• Transcriptor Reverse Transcriptase este o revers-transcriptaza noua, recombinata in E. coli, ce include o ADN polimeraza dependenta de ARN, o ADN polimeraza dependenta de ADN, cu activitate RNaza H si relaxaza. Se accepta ca matrite ADN monocatenar si ARN monocatenar in prezenta unui primer. Enzima transcrie ARN lung, fiind foarte sensibila si termostabila. Enzima mai este recomandata pentru tinte bogate in GC si reactii de marcare in cursul sintezei ADNc.
• Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit este o trusa ce ofera revers-transcrierea robusta si  sensibila a ARN din surse diverse, in combinatie cu thermal cyclers conventionale si instrumente de PCR in timp real.
• Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit combina activitatea proofreading oferita de trusa Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit, cu rezultatele mai precise si mai sensibile ale RT-PCR in 2 pasi. Se elimina posibilitatea schimbului de baze sau modificarea cadrelor de lectura, impiedicandu-se propagarea acestora in continuare prin PCR de catre ADN polimeraze. Trusa contine toti reactivii pentru RT-PCR in 2 pasi, incluzand 2 primeri (oligo(dT)-ancorati si random primer) precum si reactii de control.
• Transcriptor Universal cDNA Master este un amestec de reactie gata de utilizare pentru qRT-PCR in 2 pasi, pentru toate sistemele de PCR in timp real.

• Protector RNase Inhibitor inactiveaza un spectru larg de RNaze (incluzand RNaza A, RNaza B, si RNaza T2). Aceasta enzima este termostabila, fiind complet activa pe durata sintezei ADNc. Protector RNase Inhibitor este activ la pH 5,0-9,0 si temperaturi intre +25°C/+55°C.

Reactivi pentru RT-PCR intr-un pas

• Tth DNA Polymerase este o enzima recombinata ce prezinta ambele activitati intrinseci – transcriptaza si ADN polimeraza termostabila. Tth tolereaza temperaturi de 50°C–70°C in reactia RT si de pana la 95°C in PCR, rezolvand astfel problemele structurii secundare a ARN. Tth se preteaza procedeului de eliminare a contaminarii prin incorporarea dUTP/tratament ulterior cu UNG (Uracil N-Glucozidaza).
• Titan One Tube RT-PCR System si Titan One Tube RT-PCR Kit contin reactivi (plus controale, primeri de control, nucleotide, RNase inhibitor si apa PCR-grade) pentru analiza RT-PCR rapida, sensibila si de mare fidelitate a ARN. Se folosesc enzimele AMV Reverse Transcriptase si Expand High Fidelity PCR System. In functie de primerii selectati, se vor amplifica mesageri specifici, sau intreaga populatie de transcrisi. Aceasta metoda permite si clonarea mesagerilor rari, fara necesitatea construirii librariilor ADNc.
• Transcriptor One-Step RT-PCR Kit asigura analiza rapida, sensibila si specifica, endpoint de tip RT-PCR, a ARN (total, mesager, transcris in vitro sau viral), folosind primeri genici specifici. Trusa contine un tampon de inovatie, combinand totodata revers-transcrierea sensibila si productiva cu un sistem hot start de inalta fidelitate si randament de amplificare crescut, inclusiv cu tinte ARN bogate in GC. Transcrisii pot fi de pana la 6,5 kb si se vor folosi la determinarea calitativa, semi-cantitativa sau cantitativa a nivelurilor transcriptionale, determinarea prezentei/absentei matritelor ARN, cuantificarea expresiei genice si clonarea ARN de pana la 6,5 kb.
• Primer for cDNA Synthesis leaga terminatia 3’-polyA a unui ARNm pentru initierea sintezei unei copii de ADNc, fiind folosit pentru RT-PCR, librarii ADNc si sinteza primei catene de ADNc.

• Primer “random” contine 2 mg de primer, random pd(N)6, sare de potasiu, pentru 400 de reactii.

Amestecuri Master si truse pentru PCR

• PCR Core KitPLUS se foloseste in laboratoarele PCR in care se executa un numar mare de reactii cu perechi identice de primeri si in care exista un risc semnificativ de rezultate fals-pozitive datorate contaminarii. Gradul de reducere a contaminarii este de cel putin 10⁷ copii.  Produsii PCR continand dU vor servi ca tinte de hibridizare, matrite pentru secventarea cu terminatori dideoxi si pot fi clonati direct daca sunt transfectati intr-o gazda bacteriana UNG (Uracil-N-Glucozidaza, o enzima ce utilizeaza dU). Digestia cu endonucleaze de restrictie nu este afectata (Eco RI si Bam HI) sau este usor redusa (Hpa I, Hind II, Hind III). Pentru celelalte enzime de restrictie se va evalua individual efectul substitutiei dT cu dU asupra activitatii enzimatice. Trusa nu este recomandata pentru studii de legare a proteinelor sau studii de interactie cu ADN.
• FastStart PCR Master este un amestec de reactie hot start gata de utilizare, livrat in forma concentrata 2x, ce contine toti reactivii (cu exceptia primerilor PCR si a tintei) necesari rularii PCR standard si RT-PCR in 2 pasi.
• High Fidelity PCR Master se foloseste in locul sistemului Expand High Fidelity System sau a reactivilor separati, in cele mai multe aplicatii PCR. Singura limitare este ca volumul probei sa nu depaseasca jumatate din volumul total de reactie. High Fidelity PCR Master este stabil la +2/+8°C, permitand pornirea imediata a PCR, fara consum de timp pentru dezghetarea reactivilor. Se amplifica fragmente  de ADN si ADNc de pana la 5 kb. Amestecul are fidelitate de ~3x mai buna fata de polimeraza Taq. Apa pura PCR-grade este prevazuta in trusa.
• Pwo Master contine toti reactivii necesari pentru High Fidelity PCR (cu exceptia primerilor PCR si a tintei), livrati in formula concentrata 2x, gata de utilizare. Trusa este potrivita pentru amplificarea cu mare fidelitate (de 18x mai precisa fata de polimeraza Taq) a fragmentelor ADN de lungime moderata (≤3 kb), amplificarea ADN pentru aplicatii critice si PCR de mare capacitate. Nu este nevoie sa determinati conditiile ionice optime pentru o determinare anume, sau sa ajustati concentratiile componentelor. Concentratia ionilor bivalenti de Mg din amestec si sistemul tampon cu formula speciala permit amplificarea excelenta a celor mai multe tinte ≤3 kb. Produsul se pastreaza la 2- 8°C si poate fi utilizat imediat.

• PCR Master se utilizeaza in locul PCR Core Kit, sau a reactivilor individuali, in aproape toate aplicatiile PCR, cu singura limitare ca volumul probei sa nu depaseasca jumatate din volumul total de reactie. Stabil la +2/+8°C, PCR Master contine MgCl2 in concentratie fixa de 1,5 mM. 

Optimizarea reactiei PCR

• PCR Optimization Kit
• Uracil-DNA Glycosylase recombinant din E. coli K 12
• Uracil-DNA Glycosylase, heat-labile recombinant din bacteria marina BMTU 3346 T4 Gene 32 Protein
• Strip PCR Tubes and Caps (fie cate 8 sau 12 per strip) sunt destinate thermal cyclers pentru transfer termic rapid si optim in PCR, RT-PCR, sinteza ADNc si secventare.

• Alti reactivi generici sunt MgCl2 Stock Solution, PCR Buffer Set, PCR Buffer fara MgCl2, 10x si Apa PCR Grade, precum si o gama larga de enzime pentru PCR.

Reactivi pentru PCR in timp real

Roche va pune la dispozitie reactivi potriviti pentru siteme terte de PCR in timp real, ce nu necesita normalizare cu ROX.

• FastStart TaqMan® Probe Master, amestec de reactie hot start, pentru sonde, gata de utilizare, fara ROX, pentru qPCR si qRT-PCR*** cu alte sisteme decat LightCycler®
• FastStart SYBR Green Master, amestec de reactie hot start cu SYBR Green I, gata de utilizare, fara ROX, pentru qPCR si qRT-PCR cu alte sisteme decat LightCycler®

In cazul in care detineti un instrument ce necesita normalizare cu ROX, puteti selecta din lista de reactivi oferiti de Roche Applied Science acei reactivi necesari pentru a amplifica (pana la 500 pb) si detecta tinte ADN si ADNc, indiferent de continutul GC/AT al acestora. Amestecurile sunt stabile timp de peste 24 de ore la temperatura camerei, fiind ideale pentru aparatele de pipetare robotizate. Beneficiati de noul colorant universal de referinta, special proiectat si inclus in amestecul de reactie, ce permite evitarea pipetarilor suplimentare de ajustare a concentratiei.

• FastStart TaqMan® Probe Master (Rox) si FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) si ROX Reference Dye sunt destinate sistemelor de qPCR care necesita normalizare cu ROX.
• FastStart Universal Probe Master (Rox) si FastStart SYBR Green Master (Rox) – idem.

Pe pagina de web Roche Applied Science aveti la dispozitie un ghid interactiv pentru selectia produselor de care aveti nevoie. Petru aceasta, copiati in browser adresa https://www.roche-applied-science.com/sis/campaigns/dntp/index.jsp?id=DN030000. De asemenea, puteti consulta acest document.

Reactivi pentru PCR in timp real cu sistemele Roche LightCycler®

Reactivi si truse generice pentru LightCycler® cu carusel

Sistemele LightCycler® cu carusel ofera si amestecuri de reactie si truse speciale, optimizate pentru detectia si cuantificarea sensibila si specifica a tintei, cu evitarea acumularii produsilor secundari si a artefactelor si prevenirea formarii dimerilor de primeri. Acestea sunt combinatii unice de mixuri FastStart cu formaturi de detectie variate, incluzand sonde de hidroliza.

• Pentru reactiile RT PCR intr-un pas, folositi amestecurile de reactie hot start, gata de utilizare LightCycler® RNA Master HybProbe, ori LightCycler® RNA Master SYBR Green I, ce contin Tth in combinatie cu aptameri. Aptamerii sunt oligonucleotide dedicate ce se leaga la centrul activ al polimerazei Tth si previn atasarea acesteia la tinta, la temperaturi situate sub cea optima de reactie. Aptamerii sunt desprinsi din centrul activ la temperaturi inalte, activand astfel reactia hot-start.

• Pentru reactiile RT-PCR in doi pasi, folositi Transcriptor Reverse Transcriptase combinata cu LightCycler® FastStart DNA Master^PLUS HybProbe, ori LightCycler® Multiplex DNA Master HybProbe

* Aptamerii sunt oligonucleotide sau oligopeptide capabile sa se lege la o molecula tinta specifica. Aptamerii sunt creati de obicei prin selectie dintr-un pool mare de secvente aleatoare, dar exista si aptameri naturali, in asa-numitii ribo-comutatori(a). Aptamerii se pot folosi ca remedii macromoleculare, atat in cercetare cat si in scopuri clinice. Daca se combina cu ribozimele(b), aptamerii sunt capabili de autoscindare, in prezenta propriei molecule tinta.

^(a) Ribo-comutatorul este o parte dintr-o molecula de ARNm ce poate lega direct o molecula tinta de dimensiuni mici, in urma careia activitatea genica este afectata. Prin urmare, un ARNm ce contine un ribo-comutator este direct implicata in autoreglarea propriei activitati, ca raspuns la diferite concentratii ale moleculei tinta.

^(b) Ribozima (denumita si enzima ARN sau ARN catalitic) este o molecula de ARN cu structura tertiara bine definita ce ii permite cataliza unei reactii chimice. Multe ribozime naturale catalizeaza fie hidroliza uneia din propriile legaturi fosfodiesterice, fie activitatea aminotransferazica a ribozomilor. Ribozimele produse in laborator sunt capabile, in conditii stricte, sa-si catalizeze propria sinteza.

Truse specifice de parametru pentru LightCycler® cu carusel 

Consultati documentul Sistemele LightCycler cu carusel

Alte companii furnizoare de truse specifice de parametru si seturi pentru LightCycler® cu carusel

• Genes-4U (Neftenbach, Elvetia)
• Search-LC (Heidelberg, Germania)

Companii posesoare de licenta pentru oligonucleotide marcate compatibile cu Roche Applied Science LightCycler®

• TIB MOLBIOL (Berlin, Germania)
• Metabion (Martinsried, Germania)
• Idaho Technology (Salt Lake City, USA)
• Integrated DNA Technologies (USA)

Reactivi si truse generice pentru LightCycler® 480

Consultati si sectiunea dedicata pe portalul LightCycler® 480.

Instrumentele LightCycler® sunt concepute pentru date de omogenitate exceptionala, fara necesitatea normalizarii cu coloranti de referinta.

• LightCycler® 480 RNA Master Hydrolysis probes
• LightCycler® 480 RNA Pre-Amplification Kit
• LightCycler® 480 High Resolution Melting Master
• LightCycler® 480 ResoLight Dye
• LightCycler® 480 SYBR Green I Master
• LightCycler® 480 Probes Master
• LightCycler® 480 Genotyping Master
• LightCycler® 480 Control Kit
• SimpleProbe 519 Labeling Reagent
• LightCycler® 480 CYAN 500 Labeling Reagent

NOU ! RealTime ready Cell Lysis Kit, pentru studii rapide si de  mare performanta de expresie genica in celule cultivate, de tip qRT-PCR in doi pasi. Trusa foloseste un protocol avansat cu o singura etapa de liza a 3-30.000 celule in 5 minute la temeperatura camerei, apoi lizatul se foloseste direct la sinteza ADNc, eliminand etapa de purificare a ARN. ADNc este apoi analizat cu LightCycler® 480 de orice capacitate.

Truse speciale pentru LightCycler® 480

Informatii referitoare la Universal ProbeLibrary, RealTime Ready si miRCURY LNA™ veti gasi consultand paragraful "Aplicatii" din sectiunea PCR in timp real.

* Footprint genetic de mare capacitate, in care se foloseste o librarie de transpozoni pentru a insera mutatii destinate inactivarii genelor in celule. Se determina profilul transcriptional (prin microarray ADN  sau secventare ARN) dupa selectie (pentru rezistenta, crestere etc.) si semapeaza inactivarile mutatie/gena asociate cu selectia vizata.

** Hibridizarea substractiva este o tehnica foarte folositoare de studiu al expresiei genice in tesuturi sau tipuri celulare specifice, sau aflate intr-un anumit stadiu. Tehnica permite amplificarea prin PCR numai a fragmentelor ADNc ce difera intre transcriptomul experimental si cel de control. De semenea, pot fi evidentiate diferentele de abundenta relativa a transcrisilor ca diferente genetice intre specii. Tehnica se bazeaza pe indepartarea ADNdc format prin hibridizare intre o proba de control si una de cercetat, eliminandu-se astfel ADNc sau ADNg abundente similar, si retinandu-se numai transcrisii/secventele genomice exprimate diferential, sau cu secvente variabile.

*** Prin conventie internationala, RT inseamna revers-transcriere, iar PCR in timp real (Real-Time PCR), contrar asteptarilor, se prescurteaza cu qPCR (de la quantitative PCR)